การตรวจจําแนกสายพันธุ์เชื้อ Human Papillomavirus ชนิดเสี่ยงสูงต่อการเกิดมะเร็งปากมดลูกด้วยเทคนิค High Resolution Melting Analysis

บทคัดย่อ

มะเร็งปากมดลูกมีอุบัติการณ์สูงเป็นอันดับ 2 ของมะเร็งในสตรีไทย เชื้อ human papillomavirus (HPV) เป็นสาเหตุสำคัญของมะเร็งปากมดลูก ในการศึกษานี้จึงพัฒนาตรวจแยกเชื้อ HPV ชนิดเสี่ยงสูงที่พบบ่อยในประเทศไทย คือชนิด 16, 18, 45 และ 58 ด้วยเทคนิค real-time PCR ร่วมกับ high resolution melting analysis (HRM) เริ่มจากการทดสอบคุณภาพของ DNA ที่สกัดได้จากเซลล์ปากมดลูกโดยตรวจหา housekeeping gene (beta actin) ตัวอย่าง DNA ได้จากสถาบันมะเร็งแห่งชาติ และ DNA ที่มีคุณภาพจะนำมาเพิ่มจำนวน DNA ของเชื้อด้วย primer ที่จำเพาะต่อยีน E6/E7 ของ HPVs จีโนม จากนั้นใช้สารเรืองแสง SYBR Green และเทคนิค HRM เพื่อตรวจแยกชนิดเชื้อ โดยอาศัยความแตกต่างระหว่างขนาดของ amplified product และ %GC
contents ในยีนเป้าหมาย ซึ่งเทคนิค HRM ใช้เวลาในการทำเพียง 90 นาที เมื่อเปรียบเทียบกับเทคนิค cervista ที่ใช้ระยะเวลาทำนานถึง 4 ชั่วโมง จากการประเมินเทคนิค HRM ด้านความไวและความจำเพาะต่อดีเอ็นเอเป้าหมาย พบว่าเทคนิค HRM มีความไวในการตรวจหาเชื้อ HPV type 16, 58 ที่ 10⁴ copies และ HPV type 18, 45 ที่ 10³ copies ตามลำดับ นอกจากนี้ยังไม่พบการเกิด cross-reaction ระหว่างสายพันธุ์และจากการตรวจหาเชื้อ HPV ในตัวอย่างผู้ป่วยจำนวน 34 ราย ที่ผ่านการตรวจแยกชนิดของเชื้อ HPV ด้วยเทคนิค cervista และทราบชนิดของเชื้อ HPV แล้ว พบว่าเทคนิค HRM มีค่าความไวของ HPV16 เท่ากับร้อยละ 73.7 (n=19); HPV18 เท่ากับร้อยละ 80 (n=5) และค่าความจำเพาะของ HPV16 เท่ากับร้อยละ 100 (n=10); HPV18 ร้อยละ 90 (n=10), ตามลำดับ โดยสรุปแล้วเทคนิคที่พัฒนาขึ้นสามารถตรวจแยกเชื้อได้ง่าย รวดเร็ว และมีความจำเพาะสูง